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激情盛夏,ELISA法检测AB含量的方法
点击次数:337 发布时间:2018-07-27

 ELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定板)结合,然后将待测的ABA(样品或规范品)和兔抗ABA抗体参加微量滴定板的孔中,进行竞赛反响,接着弃去上清液,洗刷固相表面,参加酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反响,最终去除剩余的未反响的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量添加而削减,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而取得规范竞赛性抑制曲线,关于不知道样品B,只要在相同条件下测定反响后的OD值,就可以从规范曲线上查到ABA的量。
 测定办法 ELISA办法是一种固相抗原型酶联免疫法(enzyme Linked Immuno Sorbent Assay 
1.包被:在微量滴定板内精确参加100μLABA包被液,37℃湿盒过夜。 
2.标样稀释?:取8支试管每管加150μLDB,第一管中参加50μL(2000ng/50μL)规范液,充沛涡旋后,取50μL至第二号管中,相同涡旋后,取50μL到第三管;顺次稀释到第六管,稀释后的规范ABA顺次为1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng/50μL。 
3. 洗板:从37℃湿盒中取出滴定板,康复到室温后,弃去包被液,用WB(洗刷缓冲液)洗刷三次,甩干(吸水纸)。 
4.加样:1~8孔对应参加ABA标样50μL,10号孔相应参加最浓ABA标样,9号孔加50μLDB,三排重复;然后每孔加50μL抗体,37℃ 45分钟。 
5.洗板: 
6.加酶标二抗:每孔加100μL,37℃反响1小时。 
7.洗板: 
8.显色:各孔加10μLOPD显色液,37℃ 20分钟。 
9.停止反响:各孔加50μL 6NH2SO4。 
10.读数:490nm读取OD值。其间10号孔调零,而9号孔为最大值(B0),1~8号孔的OD值为B。

11.成果计算:以In(B/B0)∕(1-B/B0)为纵坐标,以规范ABA浓度的常用对数(lg[ABA])为横坐标,绘制曲线。

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